Au XVIème siècle, cette salle était la chambre de Mme d'Etampes, favorite de François 1er. Décorée par Primatice, on y retrouve, comme dans la Galerie Francois 1er, l'alliance de stuc et de fresques, réalisée entre 1541 et 1544 sur le thème de l'histoire d'Alexandre et de Roxane. Les principales fresques subsistantes sont ainsi : Alexandre domptant Bucéphale, Le Mariage d'Alexandre et de Roxane, et Alexandre épargnant Timoclée. Le style du Primatice est très différent de celui du Rosso : l'accent est mis sur la beauté du corps humain (Roxane recevant la couronne) et sur l'harmonie des lignes (figures féminines en stuc).

En 1749, Louis XV fit transformer la pièce par Gabriel en escalier pour servir d'accès à son appartement. Le plafond date de Louis-Philippe et représente l'Apothéose d'Alexandre.